原理
Western Blot與Southern印跡雜交或Northern印跡雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過(guò)PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素膜NC膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過(guò)底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)。
分類
Western Blot顯色的方法主要有以下幾種： i. 放射自顯影 ii. 底物化學(xué)發(fā)光ECL iii. 底物熒光ECF iv. 底物DAB呈色 現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL。只要買(mǎi)現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡(jiǎn)單，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過(guò)氧化物+魯米諾，如遇到HRP，即發(fā)光，可使膠片曝光，就可洗出條帶。
其他
值得一提的是，western blot 這個(gè)名稱的由來(lái)很有意思。最開(kāi)始做印跡工作的是一個(gè)叫做Southern的科學(xué)家，但印跡的對(duì)象是DNA鏈，他把這種技術(shù)稱為Southern blot，后來(lái)類似的出現(xiàn)了兩個(gè)過(guò)程相似，但是對(duì)象不同的印跡方法，一個(gè)針對(duì)RNA，一個(gè)對(duì)蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術(shù)的稱為Northern和Western，與這兩個(gè)技術(shù)的發(fā)明人沒(méi)有關(guān)系了。
western blot的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)
1. 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。
1）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡。
2）在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在中間，保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡。
3）將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。
4）將上述裝置放入緩沖液槽中，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠。
5）按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移。
6）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出薄膜和凝膠，棄去凝膠。
2. 將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。
3. 用100ml水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。
4. 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí)。
5. 室溫下，用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜。
6. 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡可能不留空氣。
7．袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊。
8．混合：NGS(100微升)，印跡緩沖液中的抗體（10毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4℃過(guò)夜）
9．用總體積300ml PBS-Tween緩沖液，分4次在一淺盤(pán)中洗滌薄膜，每次75ml。
10. 將連接生物素的羊抗兔IgG（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS）加在袋內(nèi)，于室溫下?lián)u動(dòng)1小時(shí)。
11．按步驟9洗滌。
12．加入抗生素蛋白-HRP（40微升溶于10毫升印跡緩沖液/100微升 NGS），于室溫下?lián)u動(dòng)。
注意事項(xiàng)：
western blot中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于western blot檢測(cè)。這種情況可以將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行western blot。實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。
